Na preparação para o Grande Prêmio da Itália em Mugello, Jorge Martin, o atual líder do campeonato de MotoGP, conquistou a pole position. Essa conquista se tornou ainda mais significativa pelo fato de Marc Marquez, um forte concorrente, ter caído durante sua volta que tinha potencial para superar o tempo de Martin. Marquez inicialmente registrou um tempo respeitável enquanto seguia Pedro Acosta, mas se viu em uma posição desvantajosa em sua segunda tentativa. No entanto, ele fez uma manobra audaciosa para ultrapassar Miguel Oliveira e tentou perseguir Franco Morbidelli para ter uma referência no resto da volta. Infelizmente, Marquez caiu em Scarperia, encerrando suas chances de garantir a pole position. O tempo inicial de volta de Martin, 1m44.504s, foi suficiente para garantir a pole position, apesar de não ter melhorado em sua segunda tentativa.
Pecco Bagnaia, o campeão reinante, também não conseguiu melhorar em sua segunda tentativa e largará a corrida em quinto lugar devido a uma penalidade de três posições no grid por obstruir Alex Marquez durante a sessão de sexta-feira. No entanto, Bagnaia ainda largará em segundo na corrida sprint, uma vez que a penalidade se aplica apenas à corrida de comprimento total. Maverick Vinales, pilotando pela Aprilia, conquistou o terceiro melhor tempo ao seguir de perto Bagnaia em sua primeira tentativa. Embora tenha ameaçado melhorar seu tempo no final, ele acabou se contentando com um tempo ligeiramente mais lento que ainda o colocaria na primeira fila.
Marc Marquez, apesar de sua queda, largará o Grande Prêmio da Itália em terceiro lugar, atrás de Martin e Vinales, e à frente de Bagnaia. Enea Bastianini, companheiro de equipe de Bagnaia, garantiu o quinto lugar, enquanto Franco Morbidelli, que já havia quebrado o recorde de volta no Q1, ficou em sexto lugar. Pedro Acosta, o único piloto da KTM/Gas Gas RC16 no Q2, ficou em sétimo lugar. O jovem Marquez e Aleix Espargaro, da Aprilia, completarão a terceira fila.
Alex Rins, liderando a equipe Yamaha, garantiu a décima posição, seguido por Miguel Oliveira e Raul Fernandez da Trackhouse Aprilia. Fernandez estaria na segunda fila se tivesse igualado sua performance no Q1. Uma queda do piloto convidado Pol Espargaro causou bandeiras amarelas, afetando as chances de Fabio Di Giannantonio avançar para o Q2. Di Giannantonio ficou em 14º lugar no grid.
Fabio Quartararo, pilotando a segunda Yamaha, largará em 15º lugar, perdendo por pouco um lugar no Q2 apesar do desempenho melhorado da Yamaha e de seu próprio ritmo de corrida forte. Marco Bezzecchi, companheiro de equipe de Quartararo na equipe VR46, ficou em 16º lugar, seguido por Joan Mir como o melhor piloto da Honda. Mir recebeu um vácuo oportuno de Quartararo, encerrando a sequência de Johann Zarco como o melhor piloto da Honda desde a chegada de Zarco.
Jack Miller teve uma performance decepcionante, terminando em 19º lugar na segunda KTM oficial. Ele foi seguido de perto por Augusto Fernandez da Tech3 Gas Gas e pelo piloto convidado Espargaro, apesar da queda deste último.
