Na sessão de treinos livres de abertura do fim de semana do Grande Prêmio da Itália em Mugello, Maverick Vinales, piloto da Aprilia MotoGP, assumiu a liderança. Vinales teve dificuldades na reunião anterior do fim de semana em Barcelona, com baixa aderência, lutando com a falta de sensação no pneu dianteiro e sendo superado por seu companheiro de equipe Aleix Espargaro. No entanto, ele mostrou um retorno precoce à forma no circuito de alto grip de Mugello. Seu tempo de volta de 1m46.140s o colocou dois décimos à frente de Fabio Quartararo da Yamaha. As M1s pareceram competitivas durante a sessão de 45 minutos, especialmente depois dos testes em Mugello no início deste mês.
Franco Morbidelli, ex-companheiro de equipe de Quartararo na Yamaha, terminou em terceiro como o principal piloto da Ducati. Pedro Acosta, da Tech3 Gas Gas, conseguiu garantir a quarta posição, apesar de uma queda tardia em Scarperia. Jorge Martin, da equipe Pramac de Morbidelli, ficou em quinto, seguido por Marc Marquez, seu rival pela vaga na equipe oficial da Ducati. Marquez, pilotando uma Ducati de um ano atrás pela Gresini, optou por não trocar seus pneus durante a sessão, ficando em sexto lugar, pouco mais de quatro décimos atrás do líder.
Pecco Bagnaia, o campeão reinante da Ducati, encontrou-se em uma situação semelhante, mantendo o mesmo jogo de pneus e terminando em nono lugar. Infelizmente, seu melhor tempo de volta foi excluído após a sessão, o que o teria garantido o oitavo lugar. Em vez disso, Alex Rins da Yamaha ficou com a oitava posição, seguido por Aleix Espargaro da Aprilia, que teve duas escapadas para a brita na Curva 1 (San Donato).
Apesar de manter o mesmo jogo de pneus, Alex Marquez da Gresini Ducati e Raul Fernandez da Trackhouse Aprilia obtiveram resultados decentes, completando os 11 primeiros. Pol Espargaro, um piloto convidado da KTM, iniciou seu primeiro fim de semana de MotoGP desde a final de 2023 e terminou em 15º lugar. Luca Marini foi o piloto da Honda com melhor classificação na 19ª posição, com o fabricante japonês também realizando testes.
