In der Eröffnungs-Freien-Trainingssitzung des Italien Grand Prix Wochenendes in Mugello übernahm Maverick Vinales, Aprilia MotoGP Fahrer, die Führung. Vinales hatte in der vorherigen Wochenend-Veranstaltung in Barcelona mit geringem Grip zu kämpfen, kämpfte mit einem Mangel an Gefühl im Vorderrad und wurde von seinem Teamkollegen Aleix Espargaro überholt. Bei dem hoch-gripigen Kurs in Mugello zeigte er jedoch frühzeitig seine Form. Seine Rundenzeit von 1m46.140s brachte ihn zwei Zehntel vor Fabio Quartararo von Yamaha. Die M1s sahen während der 45-minütigen Sitzung konkurrenzfähig aus, besonders nach den Tests in Mugello Anfang dieses Monats.
Franco Morbidelli, Quartararos ehemaliger Teamkollege bei Yamaha, belegte den dritten Platz als bester Ducati-Fahrer. Pedro Acosta von Tech3 Gas Gas sicherte sich trotz eines späten Sturzes in Scarperia den vierten Platz. Jorge Martin vom Pramac-Team von Morbidelli kam auf den fünften Platz, gefolgt von Marc Marquez, seinem Rivalen um einen Platz im offiziellen Ducati-Team. Marquez, der eine ein Jahr alte Ducati für Gresini fährt, entschied sich während der Sitzung nicht seine Reifen zu wechseln und beendete das Rennen auf dem sechsten Platz, knapp über vier Zehntel hinter dem Führenden.
Pecco Bagnaia, der amtierende Ducati-Meister, befand sich in einer ähnlichen Situation, behielt den gleichen Satz Reifen bei und beendete das Rennen auf dem neunten Platz. Leider wurde seine beste Rundenzeit nach der Sitzung ausgeschlossen, was ihm den achten Platz gesichert hätte. Stattdessen belegte Alex Rins von Yamaha den achten Platz, gefolgt von Aleix Espargaro von Aprilia, der zwei Ausflüge ins Kiesbett in Kurve 1 (San Donato) hatte.
Trotz des gleichen Reifensatzes erzielten Alex Marquez von Gresini Ducati und Raul Fernandez von Trackhouse Aprilia anständige Ergebnisse und belegten die Plätze 10 und 11. Pol Espargaro, ein Gastfahrer von KTM, bestritt sein erstes MotoGP-Wochenende seit Ende 2023 und beendete das Rennen auf dem 15. Platz. Luca Marini war der bestplatzierte Honda-Fahrer auf dem 19. Platz, wobei der japanische Hersteller ebenfalls Tests durchführte.
