En la sesión de entrenamientos libres de apertura del fin de semana del Gran Premio de Italia en Mugello, Maverick Vinales, piloto de Aprilia MotoGP, tomó la delantera. Vinales tuvo dificultades en la reunión anterior del fin de semana en Barcelona, con baja adherencia, luchando con la falta de sensación en el neumático delantero y siendo superado por su compañero de equipo Aleix Espargaro. Sin embargo, mostró un retorno temprano a la forma en el circuito de alto agarre de Mugello. Su tiempo de vuelta de 1m46.140s lo colocó dos décimas por delante de Fabio Quartararo de Yamaha. Las M1s parecieron competitivas durante la sesión de 45 minutos, especialmente después de las pruebas en Mugello a principios de este mes.
Franco Morbidelli, ex compañero de equipo de Quartararo en Yamaha, terminó en tercer lugar como el principal piloto de Ducati. Pedro Acosta, de Tech3 Gas Gas, logró asegurar la cuarta posición, a pesar de una caída tardía en Scarperia. Jorge Martin, del equipo Pramac de Morbidelli, quedó en quinto lugar, seguido por Marc Marquez, su rival por el puesto en el equipo oficial de Ducati. Marquez, pilotando una Ducati de un año atrás para Gresini, optó por no cambiar sus neumáticos durante la sesión, quedando en sexto lugar, poco más de cuatro décimas detrás del líder.
Pecco Bagnaia, el campeón reinante de Ducati, se encontró en una situación similar, manteniendo el mismo juego de neumáticos y terminando en noveno lugar. Desafortunadamente, su mejor tiempo de vuelta fue excluido después de la sesión, lo que le habría garantizado el octavo lugar. En su lugar, Alex Rins de Yamaha se quedó con la octava posición, seguido por Aleix Espargaro de Aprilia, quien tuvo dos salidas a la grava en la Curva 1 (San Donato).
A pesar de mantener el mismo juego de neumáticos, Alex Márquez de Gresini Ducati y Raúl Fernández de Trackhouse Aprilia obtuvieron resultados decentes, completando los 11 primeros. Pol Espargaró, un piloto invitado de KTM, inició su primer fin de semana de MotoGP desde la final de 2023 y terminó en 15º lugar. Luca Marini fue el piloto de Honda mejor clasificado en la posición 19, con el fabricante japonés también realizando pruebas.
